转基因技术是当今生命科学研究领域最基本的技术。利用转基因技术改变物种的遗传性状,从而获得新的品种或产品,则是包括基因工程在内的生物技术产业的主要研发内容。

在下面的小实验中,我们将通过基因转化的方法,把一种对氨苄青霉素敏感的大肠杆菌转化成能抵抗氨苄青霉素的大肠杆菌。其基本原理是:细菌中存在一种环状DNA,叫做质粒,它可以作为载体把外源基因(比如动物或植物的基因)携带到细菌中进行表达。如果它携带了抗氨苄青霉素的基因,那么被转化到细菌就获得了抗氨苄青霉素的遗传性状,这样原来不能在含氨苄青霉素的培养基中生长的细菌也能在其中生长了。

一般情况下,往往把要在大肠杆菌中表达的外源基因插入在含有青霉素抗性的质粒中,以便于筛选出转化的细菌。

2 实验材料

1)感受态大肠杆菌(制备方法见附录一)。

2)含有抗氨苄青霉素基因的质粒(制备方法见附录二)。

3)含有氨苄青霉素的细菌固体培养基板(制备方法见附录三)。

4)其他试剂:不含抗生素的细菌液体培养基(制备方法见附录三)。

5)器具:1.5mL的塑料离心管、1mL的吸量管、滴管和橡胶吸头、水浴锅、碎冰块、小型离心机、培养皿、涂布棒、接种环、高压灭菌锅、酒精灯、温度计、酒精棉球、超净工作台(视条件而定,如房间干净,也可直接在实验台上操作)。

3 基本步骤

1)在无菌条件下(酒精灯旁),向盛有50~100μL感受态大肠杆菌的塑料离心管中加入2μL质粒(浓度为1ng/μL),用滴管轻轻抽吸使之混合均匀,在冰上放置30min。

2)将离心管放入42℃水浴中热激90s(此处需准确计时),然后迅速转移到冰上,放置1~2min。

3)每管加入500LL无抗生素的细菌液体培养基,在37℃摇床以200r/min的转速振摇1h,也可用手每隔几分钟颠倒离心管几次。

4)将离心管放入小型离心机,以4000r/min的转速离心10min,用吸量管吸去部分上清液,使离心管中的剩余液体约为100μL,然后用滴管轻轻抽吸离心管中的剩余液体,使沉淀在管底的细菌重新悬浮在液体中。用吸量管吸取这些细菌的悬浮液,放到含有氨苄青霉素的细菌固体培养基板上,用涂布棒将细菌悬浮液涂布均匀,盖上培养皿,放置5min。

5)用与步骤4)相同的方法将没有加入质粒的感受态大肠杆菌涂布在另一块含有氨苄青霉素的细菌固体培养基板上。对两块平板要分别做好标记。

6)倒置培养基板,在37℃下培养12~16h。

7)观察培养基板,比较上面生长的菌落数目。一般情况下,1ng质粒可获得1000个转化的细菌克隆(菌落)。

4 注意事项

1)操作之前应该洗手,然后用酒精棉球擦手。

2)实验中使用的器具应高压灭菌。

3)每一步操作都要注意无菌,最好在无菌操作台内的酒精灯火焰附近进行操作。

附录一 制备感受态大肠杆菌

1)从在37℃下培养了16~20h的新鲜平板上挑取1个单菌落,接种于5mL液体LB(LuriaBeriani)培养基中,在37℃的摇床中振摇培养12h后,按1∶100比例转接于20mL液体LB中,37℃振摇培养至对数中期(约3h)。

2)将菌液转移到1.5mL离心管中,在冰上放置10min。

3)在4℃下,以4000r/min的转速离心10min,弃上清,加入原菌液13体积的用冰预冷的0.1molCaCl₂溶液悬浮菌体,在冰上放置30min。

4)在4℃下,以4000r/min的转速离心10min,弃上清,加入原菌液112体积和用冰预冷的0.1mol

CaCl2溶液,悬浮菌体,在冰上放置10min。

做好的感受态细胞可立即用于转化,也可存于4℃冰箱,于1周内使用;或者加入20%体积的无菌甘油,存于-70℃超低温冰箱备用。

附录二 碱裂解法提取质粒

1)将2mL含有相应抗生素的LB培养基加入15mL的试管中,接入单菌落,在37℃下,以200r/min的转速振摇培养过夜。

2)将1.5mL培养物转入小塑料离心管中,离心弃去上清液。

3)向离心管中加入100μL在冰上预先冷却的溶液Ⅰ,剧烈振荡,使细菌沉淀和溶液Ⅰ混匀。

溶液Ⅰ:50mmol葡萄糖

10mmolEDTA(pH8.0)

25mmolTris·HCl(pH8.0)

4)加入200μL新配制的溶液Ⅱ,盖紧离心管,迅速颠倒4~5次,在冰上放置5min。

溶液Ⅱ:0.2molNaOH

1%SDS

5)加入150μL预冷溶液Ⅲ,盖紧离心管,颠倒混匀,冰上放置10min。

溶液Ⅲ(100mL):5mol/L乙酸钾60mL

冰乙酸11.5mL

水28.5mL

6)将离心管放入小型离心机,高速离心后将上清液抽取到另一个干净的小塑料离心管中。

7)向离心管中加入等体积氯仿(450μL),剧烈振荡使上清液与氯仿混合成乳浊液,以12000r/min转速离心10min。

8)离心后将上清液抽取到另一个干净的小塑料离心管中,向上清液中加入2倍体积的无水乙醇,在4℃下沉淀20min,或在-20℃下沉淀10min,然后以12000r/min的转速离心10min。

9)弃上清,向离心管中加入1mL70%酒精洗涤沉淀,弃去酒精后将沉淀晾干或用真空泵抽干。

10)用50μL含无DNA酶的胰RNA酶(20μg/mL)的无菌纯水溶解沉淀,存于-20℃。对质粒作酶切,电泳分析进行鉴定。

附录三 细菌培养基制备方法

1)        液体LB培养基(Luria-Bertani)

配制每升培养基,应在950mL蒸馏水中加入:

胰蛋白胨(bacto-trytone)  10g

酵母提取物(bacto-yeastextract)  5g

NaCl  10g

振荡容器直至溶质完全溶解,用5molLNaOH(约02mL)调节pH值至7.0,加入蒸馏水至总体积为1L,在15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌2min。

如果需要加入抗生素,须在灭菌后待温度降至50℃以下时在超净台中加入无菌的抗生素。

2)含有琼脂的培养基(铺制平板用)

高压灭菌后前向前述的液体LB培养基中加入细菌培养用琼脂(bacto-agar)15gL,在15lbf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min。从高压灭菌锅中取出培养基时轻轻振摇以混匀液体,当心液体过热旋动可能会发生暴沸。当培养基温度降至50℃左右时,在超净台中加入无菌的抗生素并旋动混匀培养基,避免产生气泡。然后直接从烧瓶中把培养基倒入培养皿中。培养皿应事先高压灭菌,90mm直径的培养皿约需30mL培养基。

将培养基在超净台中吹至完全凝固后,倒置储存于4℃冰箱中备用。

说明:

1)感受态细菌也可按比例大量制备,然后分装在0.5mL的塑料离心管中(每管50~100mL,如不考虑转化率,减少实验成本,感受态细菌用量可减少一半或更少一些),如果近期内便用,也可贮存在-20℃冰箱中。

2)感受态细菌和质粒均可向附近的科研单位索取或从生物试剂公司购置,实验材料成本每人每次约5元。

3)考虑该实验是生命科学研究和生物技术中最基本的实验技术,开设这一实验课的难度不大,成功率高,操作中很多步骤还可以简化。

作者：朱逢雪 谭 磊(北京大学生命科学学院北京100871)